脉络丛肿瘤类器官揭示Wnt/β-catenin信号通路激活促瘤关键机制
更新时间：2024-09-29 17:13 浏览量：28
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
脉络丛肿瘤（CPT）是一种罕见的肿瘤，约占1岁以下儿童肿瘤的20%，恶性病例的5年生存率约为40%。CPT由于其罕见性和目前对脉络丛生物学的有限了解而被严重忽视。作为一种驱动基因未知的肿瘤，CPT的转化研究既缺乏病理学认识，又缺乏可靠的模型系统。这项多学科研究表明，Wnt/β-catenin信号的激活在CPT肿瘤发生中起重要作用，且通过敲除肿瘤抑制基因APC（腺瘤息肉病大肠杆菌）诱导了第一个CPT类器官的产生。该研究揭示了CPT的发病机制是一个关键发育通路失调的结果，并提供了一个基于人类细胞的体外3D模型，极大地促进CPT的基础研究和治疗开发。
文章介绍
题目：Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus
杂志：Neuro-Oncology
影响因子：IF=16.4
发表时间：2024年8月
#1
研究背景
Background
CPT基因组的特征是大量而频繁的染色体不稳定事件。据报道，在脉络丛癌中分别有高达50%和44.4%的体细胞和生殖细胞系发生TP53突变，在成人脉络丛乳头状瘤和不典型脉络丛乳头状瘤中有高达18%的TERT启动子突变，但大多数CPT，无论是儿童还是成人，都缺乏复发性的基因驱动突变。最近的体内研究表明，单独进行肿瘤抑制基因（如Tp53、Rb、Pten）敲除、原癌基因Notch1过表达或c-Myc过表达，或联合Tp53的缺失足以在小鼠中诱导CPT发生。由于遗传和转录组谱的相似性有限，仍然不确定这些模型中哪一个接近模拟人类CPT的生物学。因此，驱动人类CPT发病的机制在很大程度上仍未被探索。
儿童CPT主要是恶性的，这表明这些肿瘤可能是由于祖细胞发育过程中选择性通路的破坏和/或驱动局部微环境影响的细胞间相互作用的破坏而产生的。脉络丛上皮来源于顶板神经上皮增生的假层状祖细胞，控制其发展的明显候选者是由神经管组织中心区域分泌的信号分子，如BMPs和WNT配体。具体来说，端脑脉络丛来源于富含BMP/WNT/MSX的皮质边缘，而后脑脉络丛来源于WLS/MATH1/PAX6阳性的上菱唇。所有脉络丛祖细胞均高表达Rspo2-3基因，该基因编码Wnt/β-catenin信号R-spondins增强子。Wnt/β-连环蛋白通过经典的跨膜信号传导作用于质膜。Wnt配体由豪猪素(PORCN)棕榈酰化并自分泌或旁分泌方式发挥作用。分泌型Wnt配体与卷曲受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)共受体结合，诱导细胞质信号级联，从而稳定转录共激活因子β-catenin。这一事件与抑制含有APC和GSK3β的破坏复合体有关。
这项研究发现Wnt/β-catenin信号是CPT发生的关键调控通路。Wnt/β-catenin基因的生物信息学分析显示，人类CPT在基因组和转录组水平上都存在破坏。该研究证明，Wnt/β-catenin激活(i)诱导脉络丛细胞系的致癌特性，(ii)通过GSK3β抑制剂CHIR处理系统激活时，减少脉络丛类器官的分化，(iii)在APC消融下诱导脉络丛类器官的肿瘤形成。这些发现共同证明Wnt/β-catenin信号的激活对CPT的发生至关重要。
#2
研究关键点
Methods
1、对CPT患者的基因组和转录组数据进行多组学数据分析；
2、使用CRISPR-Cas9技术对体外培养的CPT细胞系进行基因编辑；
3、构建人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的3D脉络丛类器官模型并进行APC基因敲除进行病理学研究。
#3
关键研究结果
Results
1、CPT患者携带与Wnt/β-catenin信号通路相关的多个基因组和转录组变化
为了确定参与ChP肿瘤发生的信号通路，该研究分析了为数不多的包含CPP和健康ChP对照的基因表达微阵列数据集之一。差异表达基因(DEGs)分析鉴定出7784个基因在CPP中表达量至少增加或减少两倍。IPA工具鉴定出“Wnt/p-catenin信号”是肿瘤中几个显著激活的通路之一。为了了解Wnt/β-catenin信号传导在CPT中是如何改变的，通过合并两个GO(“Canonical Wnt pathway”和“Regulation of Canonical Wnt”)生成一个GO列表Wnt2GOs，然后使用该基因列表对DEG列表进行子集化。结构发现450个具有统计学意义的基因，其中90个基因上调（括配体WNT2B、受体FZD2、正调节因子EGR139和反馈抑制剂WIF140），131个基因下调（包括APC、SFRP1、SOSTDC1、CYLD、SIAH1）。许多体细胞和种系SV位于Wnt/β-catenin信号基因的上游或下游，包括缺失、重复、倒置和易位。大多数SV的平均大小为1 Kb，其中一小部分可达100 Mb。大多数SV没有定位在基因上，但它们仍然发生在2 Kb – 5 Mb的距离内，含有可能的调控元件，从而可能影响Wnt/β-catenin通路基因的表达。
为了排除正常多态性，对次要等位基因频率采用为了确定所鉴定的Wnt/β-catenin信号的遗传改变的相关性，计算了与Wnt/β-catenin信号和其他常见致癌途径相关的SNV/Indel变异的比例，发现Wnt/β-catenin信号在体细胞和种系变异中都是第二富集的途径（图1）。
图1 人脉络丛肿瘤中Wnt/β-catenin信号的转录组学和基因组学变化
2、Wnt/β-catenin信号在人CPT中激活
为了验证Wnt/β-catenin信号在CPT中的激活作用，对人肿瘤样本进行β-catenin (CTNNB1)染色，定性和定量分析显示，β-catenin在CPT细胞质和细胞核中的定位增加。通过β-catenin和TTR双染色证实β-catenin的细胞定位，结果与之前在人和犬CPTs中β-catenin染色一致，表明Wnt/β-catenin信号通路的激活增强。与这些观察结果一致，真正的Wnt/β-catenin靶基因AXIN2的mRNA表达和蛋白水平升高。Wnt/β-catenin信号负调控因子(如APC和SFRP1)的mRNA水平下调，而APC相关靶基因(如SP5和NOTUM)的mRNA水平上调。CPT样本中β-catenin蛋白水平升高，但未影响其mRNA水平。最后，测量了活化CTNNB1(未磷酸化的Ser37/Thr41)占总CTNNB1的比例，结果显示增加，特别是在CPP中。独立测量DVL2蛋白表达水平和磷酸化DVL2的比例也显示出增加，特别是在CPP中。由于人类CPC样本的可用性有限，DVL2和活化的CTNNB1蛋白分析仅在一个生物CPC样本中进行。以上数据表明Wnt/β-catenin通路在人类CPT样本中被激活（图2）。
图2 人脉络丛肿瘤显示Wnt/β-catenin信号通路的激活
为了研究CPT对Wnt/β-catenin信号通路的依赖性，使用PORCN抑制剂WNT974抑制人CPP细胞系HIBCPP中Wnt配体的分泌。WNT974以剂量依赖性的方式降低HIBCPP细胞活力。TOPFlash实验显示，HIBCPP细胞确实表现出自分泌的WNT信号，并且WNT974处理下调了WNT/β-catenin活性。此外，Wnt/β-catenin靶基因(AXIN2、MYC)和其他反馈调节因子(WIF1、DKK1)的mRNA表达也被WNT974降低。靶蛋白AXIN2和转录共激活因子CTNNB1的蛋白水平在药物治疗后下调，这导致克隆实验中的菌落数量显著减少。通过流式细胞术测量，WNT974还显著增加了G1期(G1阻断)的细胞百分比，减少了S期的细胞百分比。此外，药物治疗后结合EdU的细胞数量减少，表明自分泌WNT是HIBCPP细胞周期进展所必需的。使用Annexin V/PI染色进行细胞死亡分析，显示活细胞(AV-/PI-)减少，死亡细胞总体增加，但凋亡(AV+/PI-)未增加，进一步cleaved Caspase-3的免疫荧光染色证实了这一点（图3）。
图3 人脉络丛肿瘤细胞依赖于Wnt/β-catenin信号
3、Wnt/β-catenin信号的激活可诱导肿瘤发生
为了评估Wnt/β-catenin信号在ChP肿瘤发生中的作用，建立了Wnt信号激活的2D体外模型。APC是Wnt/β-catenin信号传导癌症的最重要驱动因素之一，在CPP中表达降低4倍。利用CRISPR/Cas9技术敲除永生性大鼠脉络膜上皮细胞系Z310细胞中的Apc基因，阻断了β-catenin破坏复合体的形成，从而组成性地激活了Wnt/β-catenin信号通路。选择3个独立的Apc敲除(Apc_KO)克隆进行分析。Apc_KO细胞系显示TOPFlash发光信号显著增加，超过外源性WNT3A处理的细胞水平。Axin2 mRNA水平在Apc_KO细胞中上调，且Western blot证实APC在所有克隆中均缺失，AXIN2和CTNNB1蛋白水平上调。Apc_KO细胞系细胞核中β-catenin积累，细胞质定位增加，进一步证实了Apc_KO细胞系中Wnt/β-catenin通路的激活。Apc_KO细胞能够形成更多的菌落，显示出更强的不依赖于锚定的生长能力，这是致癌转化的标志。接下来，使用优化的器官型脑切片侵袭试验评估Apc_KO细胞的侵袭能力，数据显示，Apc_KO球体从球体核心延伸出更多更长的突起，与对照组相比，显示出显著增加的侵袭能力。接下来，通过在Z310细胞系中过表达WNT3A配体(WNT3A OE)来激活Wnt/β-catenin信号，并选择3个独立的WNT3A_OE单克隆进行分析。与对照组相比，WNT3A_OE细胞的TOPFlash发光信号增加了3-5倍，并且对DKK1蛋白的WNT抑制有反应。与Apc_KO一样，WNT3A OE细胞显示AXIN2 mRNA和蛋白水平升高，TNNB1总蛋白水平显著升高。WNT3A_OE细胞抗β-catenin染色显示核积累。所有无性系均有增加菌落形成的趋势。当将WNT3A OE球体植入小鼠器官型脑切片时，也表现出增强的侵袭能力。尽管Apc_KO和WNT3A_OE这两种2D体外模型都旨在持续激活Wnt/β-catenin，但它们的功能读数和致瘤性特征在作用程度上略有不同。这可能是由于Wnt/β-catenin信号通路的激活幅度不同（图4）。
图4 Wnt/β-catenin信号激活诱导2D体外模型转化
4、Wnt/β-catenin通路的全身性过度激活导致脉络丛类器官分化减少
为了研究Wnt/β-catenin在具有更复杂时空组织的脉络丛3D模型中的激活，首先从hiPSC中生成了脉络丛类器官。为了评估Wnt/β-catenin信号激活增加对成熟hiPSC衍生脉络丛类器官的影响，我们用高剂量5 μm CHIR 99021 (CHIR，Wnt/β-catenin信号激活剂)治疗第40天至第60天的类器官。通过KI67染色发现CHIR处理的类器官在脉络丛上皮谱系标记物OTX2呈更大范围阳性，细胞密度和增殖率保持不变。相反，CHIR处理的类器官显示多个脉络丛分化标记物的蛋白表达降低，包括TTR、AQP1和KIR7.1。转录分析证实TTR、AQP1、HTR2C和CLIC6等多个分化标志物显著降低。相反，Wnt/β-catenin通路的基因显著上调，包括AXIN2、LEF1-a核效应因子和DKK1-a反馈调节因子。蛋白定量证实，在CHIR处理的类器官中，AXIN2和CTNNB1蛋白水平升高。CHIR处理的类器官未发现明显的肿瘤特征。综上所述，CHIR处理有效激活了脉络丛类器官中的Wnt/β-catenin通路，导致OTX2+ ChP谱系细胞分化程度较低（图5）。
图5 hiPSC衍生脉络丛类器官中Wnt/β-catenin通路的系统性激活
5、APC敲除足以诱导Wnt/β-catenin信号激活和脉络丛类器官的肿瘤形成
由于APC mRNA在人类肿瘤中的表达降低以及Apc_KO在脉络丛细胞系中诱导的致瘤性特征，该研究使用CRISPR-Cas9敲除脉络丛类器官中的APC基因。使用携带空载体Cas9-mCherry (sgEV)或sgRNACas9-mCherry (sgAPC)载体的慢病毒转导成熟的脉络丛类器官(第40-45天)以敲除APC，并保存至第60-65天，等待肿瘤生长。成熟阶段的基因工程引发了异质性改变，更好地模拟了肿瘤发生过程，并产生了嵌合脉络丛类器官，其正常脉络丛区域与肿瘤区域相邻。经转导的脉络丛上皮细胞(通常位于类器官周围)被证实为mCherry阳性。OTX2染色证实mCherry+区属于脉络丛谱系，Ki67染色显示细胞密度和细胞增殖增加。与人CPT一样，肿瘤脉络丛类器官TTR表达降低，主要含有单毛和非纤毛上皮细胞，这符合转化组织中纤毛缺失的特点，具有上皮转化和侵袭性增强的特点。组织病理学分析显示，在sgEV类器官中，KIR7.1 (CPTs的特异性致病标志物)在沿根尖边界信号强烈，细胞质表达很少。相比之下，sgAPC类器官的特征是在膜和细胞质区室都有强烈的KIR7.1表达。FAC分选的mCherry+细胞进行RT-qPCR，结果显示Wnt/β-catenin信号明显激活，多个已知成分的mRNA水平显著升高：靶基因(AXIN2、DKK1、MYC)，受体(LRP6)和效应物(CTNNB1、LEF1)。Western blot结果还显示，APC_KO细胞AXIN2和CTNNB1表达水平升高。这些数据证实了Wnt/β-catenin信号在sgAPC类器官细胞中的激活（图6）。
图6 APC缺失诱导hiPSC源性脉络丛类器官发生肿瘤。
小结
该研究发现，在人类CPTs中，涉及多个Wnt/β-catenin基因的基因组和转录组改变非常普遍，还证明CPT细胞依赖于Wnt/β-catenin信号，并且该途径的离散激活足以在2D模型和3D hiPSC衍生的ChP类器官中诱导肿瘤发生。总之，我们的数据表明Wnt/β-catenin信号的激活是CPT肿瘤发病的关键步骤。
参考文献
Hoa Ho K, Trapp M, Guida C, Ivanova EL, De Jaime-Soguero A, Jabali A, Thomas C, Salasova A, Bernatík O, Salio C, Horschitz S, Hasselblatt M, Sassoe-Pognetto M, Čajánek L, Ishikawa H, Schroten H, Schwerk C, Acebrón SP, Angel P, Koch P, Patrizi A. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 2024 Aug 31:noae176. doi: 10.1093/neuonc/noae176. Epub ahead of print. PMID: 39215664.
Nature | 首次将血管类器官应用于模拟糖尿病血管病变疾病
心脏类器官项目获省自然攀登立项！最新高分综述全面解析心血管类器官研究进展
Cell Stem Cell | 利用【脊髓类器官】模型，阐明脊髓发育早期微环境对神经再生的作用
重磅推荐！首次建立基于类器官的药敏试验在肿瘤精准医疗和药物开发中的应用共识
突破！利用脑类器官与乳腺癌细胞共培养，体外模拟乳腺癌脑转移机制
IF14+ 创新应用！中山大学一附院团队成功构建人纤毛外翻型鼻类器官，填补气道上皮分化中基质金属蛋白酶作用机制的空白
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社